Phát hiện và định lượng NHPB bằng phương pháp PCR mới

Bởi: Admin

13/02/2019

108

Đây là phương pháp được mô tả hoàn toàn mới như một công cụ tiềm năng trong việc xác định mầm bệnh do vi khuẩn necrotising hepatopancreatitis gây ra (bệnh hoại tử gan tụy trên tôm).

Necrotizing hepatopancreatitis (NHP) là một bệnh do vi khuẩn Gram âm đã được phân loại là Hepatobacter penaei (NHPB) gây ra. Bệnh này ảnh hưởng đến hoạt động nuôi tôm thẻ ở nhiều quốc gia châu Mỹ gồm Mỹ, Mexico, Belize, El Salvador, Guatemala, Honduras, Costa Rica, Nicaragua, Panama, Brazil, Colombia, Ecuador, Peru và Venezuela.

NHP là một bệnh mãn tính gây ra tỷ lệ tôm chết đến 50 - 95% trong quần thể ao nuôi tôm post, tôm giống và tôm thẻ chân trắng trắng Thái Bình Dương bố mẹ. Việc chẩn đoán các dấu hiệu lâm sàng của NHP tại cấp độ trang trại bị phụ thuộc vào điều kiện môi trường như độ mặn cao và nhiệt độ cao. Tôm bị nhiễm bệnh NHP thường có dấu hiệu vỏ mềm, thân nhũn, ăn kém và hệ tiêu hóa ruột giữa trống rỗng.

Quá trình nhiễm bệnh NHP được chia làm 2 giai đoạn: cấp tính và mãn tính. Giai đoạn cấp tính ở tôm bị nhiễm bệnh NHP gồm hiện tượng hoại tử và bong tróc tế bào biểu mô bên trong gan tụy (HP) và gây ra những vệt màu đen trên ống gan tụy. Ở giai đoạn mãn tính, những tổn thương ở gan tụy thấy được như teo ống gan tụy, giảm số lượng tế bào biểu mô, giảm tế bào R và F.

Từ khi được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1988, NHP trở thành một dịch bệnh nghiêm trọng trong ngành công nghiệp nuôi tôm tại phía tây bán cầu. Năm 2010, dịch bệnh này được đưa vào danh sách “Dịch bệnh trên giáp xác” của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE). Rất nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh đã được nghiên cứu để phát hiện dịch bệnh NHPB như phương pháp PCR, mô học, lai tại chỗ (ISH) và qPCR. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp PCR được OIE khuyến nghị sử dụng. Điều đó đặt ra nhu cầu cần phải có các phản ứng PCR và PCR thời gian thực (qPCR) để phát hiện và chẩn đoán dịch bệnh NHPB.

Những phản ứng PCR và qPCR hiện nay được dựa trên sự khuếch đại của gen 16S rRNA được phát triển tại phòng thí nghiệm bệnh học NTTS thuộc trường Đại học Arizona (UAZ-APL). Đây cũng là những phương pháp duy nhất được OIE khuyến nghị sử dụng để phát hiện dịch bệnh NHPB. Mặc dù những kỹ thuật này khá nhạy và đặc hiệu để phát hiện NHPB ở tôm, trong những năm gần đây, thỉnh thoảng sự khuếch đại không đặc hiệu được quan sát thấy ở điểm cuối PCR khi sàng lọc những mẫu để phát hiện NHPB trong các bào nang artemia được gửi đến UAZ-APL.

 

Nâng cao đặc hiệu trong phát hiện NHPB

Để nâng cao tính đặc hiệu của việc phát hiện NHPB bằng phương pháp PCR và qPCR, chúng tôi đã nhắm đến một vùng gen có tiên mao NHPB, gọi là protein tiên mao hình móc (flgE), vốn chỉ xuất hiện ở khuẩn mao. Những gen mang tiên mao đã tiến hóa và tách ra thành những nhóm vi khuẩn khác nhau, khiến cho vùng gen này có độ đặc hiệu rất cao để phát hiện NHPB.

Điện di trên gel Agarose của các PCR amplicon (bản sao diễn rộng chuỗi di truyền DNA) sử dụng các cặp mồi 16S rRNA từ 2 mẫu bào nang artemia (bên trái tấm panel). Tấm panel bên phải cho thấy 2 mẫu được khuếch đại bằng các đoạn mồi flgE (hình 3). Không như sự khuếch đại đại bằng đoạn mồi 16S rRNA, sự khuếch đại bằng đoạn mồi flgE không hề cho thấy những sản phẩm khuếch đại trong điện di trên gel. Sự sắp xếp theo chuỗi amplicon từ những đoạn mồi 16Sr RNA đã xác định sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu.

Chúng tôi cũng phát triển một phương pháp qPCR mới nhắm đến vùng flgE tương tự và bằng cách sử dụng đầu dò thủy phân TaqMan (được thiết kế để tăng độ đặc hiệu của PCR định lượng). Phản ứng qPCR để phát hiện NHPB không cung cấp bất kỳ sự khuếch đại không đặc hiệu nào, vì nó đạt được bằng các phản ứng qPCR OIE, và giới hạn phát hiện của xét nghiệm qPCR này lên tới 100 bản sao.

 

Độ nhạy

Phân tích độ nhạy của phương pháp PCR mới được thực hiện bằng 10 mẫu dương tính NHPB từ 7 nguồn gốc với 2 chuỗi đoạn mồi khác nhau: 16S rRNA và flgE trong hình 4, bên trái của gel agarose cho thấy những mẫu được khuếch đại bằng phương pháp được OIE khuyến nghị sử dụng hiện nay (16S rRNA); bên phải là những mẫu được khuếch đại bằng phương pháp mới. Cả hai phương pháp cho  kết quả tương tự.

Để xác định được độ đặc hiệu của khuếch đại sử dụng gen flgE, DNA tách từ tôm nhiễm bệnh do virus gây ra gồm IMN, YHD, IHHN, WSD và TS, và bệnh do vi khuẩn, gồm V. parahaemolyticus, V. harveyi, Spiroplasma penaei, V.parahaemolyticus  gây ra các bệnh AHPND và NHPB được sử dụng như mẫu để khuếch đại PCR. Tất cả các bệnh của tôm đều âm tính, ngoại trừ NHPB. Điều này cho thấy độ đặc hiệu cao của những đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại gen flgE trong việc phát hiện NHPB.

Chúng tôi cũng làm rõ quan hệ phát sinh loài của NHPB phân lập thu được từ những vùng địa lý khác nhau. Những mẫu dương tính NHPB được sử dụng trong nghiên cứu này có nguồn gốc từ Texas, Mỹ (mẫu a và b từ năm 2016); Ecuador (2011); Mexico (2011); Mexico (2013); Texas, Mỹ (mẫu a, b và c từ năm 2013); Eucuador (mẫu a và b từ 2015) và Honduras (2016). Phân tích phát sinh loài dựa vào gen 16S rRNA thể hiện trên 2 nhóm: một nhóm chứa các phân lập từ Ecuador, trong khi nhóm thứ 2 chứa các phân lập từ Mexico và Texas (Hình 5). Những mẫu từ Ecuador vào năm 2011 và 2015 được đưa vào cùng một nhóm có sự xuất hiện của các phân lập NHPB giống nhau.

 

Các dấu hiệu của NHPB tại trại nuôi

NHP được ghi nhận xuất hiện trong quần thể tôm bố mẹ và cận bố mẹ ở các trại nuôi tôm tại châu Mỹ gây ra tỷ lệ tôm chết khác nhau. Ở một số quốc gia, như Colombia, NHP không gây ra tỷ lệ chết nghiêm trọng như báo cáo ở các quốc gia khác, và dấu hiệu lâm sàng đặc trưng của NHP không phải lúc nào cũng được phát hiện ra. Hiện tượng này có thể liên quan đến các dòng tôm kháng bệnh NHP. Cũng có khả năng các NHPB phân lập có mức độ và khả năng gây bệnh đa dạng, dẫn đến tỷ lệ chết khác nhau ở những khu vực nuôi tôm khác nhau.

 

Triển vọng

Chúng tôi đã mô tả các phản ứng PCR thông thường và qPCR dựa vào gen flgE NHPB như một phương pháp thay thế để phát hiện và định lượng NHPB trong tôm và các mẫu có liên quan đến tôm, gồm artemia.

Cả hai phản ứng đều có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Độ nhạy của PCR flgE NHP tương tự như phương pháp đang được đề xuất bởi OIE hiện nay, nhưng do độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp theo khuyến nghị của OIE, nên phương pháp mới sẽ là một công cụ tiềm năng trong việc chẩn đoán dịch bệnh này.

Tiến sĩ Luis Ferrnando Aranguren - Phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản - Đại học Arizona, Mỹ

Hãy là người đầu tiên bình luận cho bài này